Sci Adv ∣ 孙博沈彬合作揭示Cas9复合物结合位点及

发布时间:2019-11-19   转载请注明:http://www.icicici.com/zhongguokexue/2019/1119/2052.html 
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  综上,作者结合单分子和生化实验,证明post-PAM interaction这一全新作用位点对Cas9/sgRNA与目标DNA的结合、切割、解离均有着关键的调节作用。该工作为进一步提高CRISPR-Cas9系统的精确性和安全性提供了一个全新的视角。

  此篇报道中,研究人员利用单分子光镊DNA解链(unzipping)技术,以近单碱基的空间分辨率检测了来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的spCas9/sgRNA与DNA之间相互作用的位点及强度(图1)。出人意料的是,除了在spCas9的20 碱基对识别区内近PAM的位置检测到一个可预知的强作用位点-前PAM互作位点(pre-PAM interaction)外,作者在PAM下游检测到一个全新的相互作用位点-后PAM互作位点(post-PAM interaction)。虽然该位点弱于pre-PAM interaction,但是将其破坏后,会导致整个三元复合体立刻崩塌。在sgRNA和目标DNA错配的情况下,post-PAM interaction仍然存在,说明这个结合位点可能先于R-loop的形成。为了进一步验证post-PAM interaction的重要性,作者通过逐步截短PAM下游的DNA序列,发现 Cas9的结合和切割能力均随着下游序列的变短而逐渐下降。此外,如果提前占据目标DNA上post-PAM interaction的位置,亦会影响Cas9的结合和切割。这也一定程度上解释了作者之前的发现【5,6】:在使用Cas9 nickase/dual sgRNAs对DNA进行切割时,PAM尾对尾(tail to tail或PAM-out)的切割效率要远高于PAM头对头(head to head,或PAM-in)的方式。这是因为PAM头对头时,占据了彼此的post-PAM interaction的位点,影响了Cas9 nickase和目标DNA的结合。

  原标题:Sci Adv ∣ 孙博/沈彬合作揭示Cas9复合物结合位点及关键分子机制

  post-PAM interaction有什么生物学意义呢?之前研究报道,Cas9切割目标DNA之后,仍然会长时间结合在目标区域【7-9】,从而会影响DNA的修复。作者进一步利用DNA修复型解旋酶BLM研究其能否有效解离与目标DNA结合的Cas9蛋白。实验发现BLM更容易从PAM下游方向将Cas9与DNA解离,这也和前面发现的post-PAM interaction弱于pre-PAM interaction相一致。

  孙博 博士,上海科技大学生命科学与技术学院助理教授、研究员。长期从事利用单分子技术(光镊、磁镊、FRET等)解析核酸互作蛋白的分子机制的相关研究,尤其聚焦于马达蛋白(例如:解旋酶,聚合酶、核酸酶等)的酶反应动力学过程及其相应的生物学功能。先后以第一或通讯作者身份在Nature、Nature Communications、Science Advances、EMBO Journal等国际主流期刊发表多篇研究论文。

  CRISPR-Cas系统是细菌和古菌在长期演化过程中形成的免疫防御系统,用以对抗入侵的病毒及外源核酸【1】。目前,II类CRISPR-Cas系统中来源于酿脓链球菌的Streptococcus pyogenes Cas9(spCas9)研究最为广泛。在该系统中,Cas9蛋白作为核酸内切酶识别前间区序列临近基序(protospacer adjacent motif, PAM)【2,3】,在指导RNA(guide RNA, gRNA)的指引下匹配目标DNA序列后激活蛋白的酶切活性。正是由于这种精准的靶向功能,CRISPR/Cas9系统已被广泛应用于各物种的基因编辑、基因的激活和抑制、定位成像、病毒检测、细胞谱系追踪等诸多领域【4】。然而, Cas9蛋白天然存在脱靶效应,虽然多个研究组对这一系统进行了各种优化,但是还是存在诸多不可预知的风险,特别是应用到临床上,其安全性更值得慎重考虑。因此,有必要对CRISPR/Cas9从各个层面进行深入研究,以提高这一体统的精确性和安全性。

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